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本发明公开了一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体及制备方法和应用,杂交瘤细胞KA/2A9,CCTCC,NO:C201184。步骤:A、将半抗原吉他霉素与牛血清白蛋白偶联得到免疫原;B、将半抗原吉他霉素与卵清蛋白偶联得到包被原;C、利用免疫原制备得到杂交瘤细胞株KA/2A9所分泌的单克隆抗体;D、用包被原包被固相载体;E、将待测样品用偏磷酸/乙醇下提取、乙酸乙酯反萃取,氮气吹干、样品稀释液得到待测物;F、对待测物进行酶联免疫检测。一种吉他霉素残留检测的试剂盒及应用,包括:包被有包被原kitasamycin-AOAA-OVA的酶标板;吉他霉素标准品溶液;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液;浓缩磷酸盐缓冲液;浓缩洗涤液;底物混合液;终止液。方法具有简便、快速、灵敏、准确的特点。