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本发明公开了一种高效毛细管电泳分离3-羟基戊二酸单酯对映异构体的方法,包括如下步骤:1)配置3-羟基戊二酸单酯样品溶液;2)配制pH为5~7的缓冲溶液,在所述的缓冲溶液中加入手性选择剂,超声脱气,用微孔滤膜过滤,过滤完毕继续超声脱气,所得溶液为电泳缓冲液;3)将步骤1)配制的3-羟基戊二酸单酯样品溶液在毛细管电泳条件下,使用步骤2)制得的电泳缓冲液使(R)-3-羟基戊二酸单酯和(S)-3-羟基戊二酸单酯对映体实现基线分离。本发明通过在高效毛细管电泳缓冲液中加入手性选择剂,构建合适的手性选择环境,利用其与对映异构体之间的作用差异进行分离,具有分离效果好、灵敏度高、准确性好等特点。